在研項目

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)屬于黃病毒科中的一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒，能引起豬只發(fā)生急性、熱性和全身敗血性疾病。CSFV野毒株的毒力差異很大，強毒株可引起豬只發(fā)生典型的豬瘟癥狀，通常表現(xiàn)為高熱、極度嗜睡、體內(nèi)器官呈敗血性變化，致死率高，臨床上比較少見；中等毒力的毒株可引起豬只高熱、輕度嗜睡、淋巴器官內(nèi)輕度出血，但致死率低。妊娠母豬感染CSFV后可經(jīng)胎盤垂直傳遞給胎兒，產(chǎn)生弱仔豬、死胎、木乃伊胎；種用公豬感染CSFV后引起精液帶毒；初生仔豬感染CSFV后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為持續(xù)性感染并終身帶毒，出現(xiàn)免疫耐受。近年來，CSFV給世界各地養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，盡管豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)可以有效預(yù)防豬瘟的發(fā)生，但在免疫壓力和氣候環(huán)境等多種因素的影響下，CSFV已經(jīng)出現(xiàn)變異。胡玲玲等分離出CSFV GZA株，該毒株的E2基因序列與我國CSFV參考毒株序列［標(biāo)準化強毒株Shimen株(GenBank登錄號為AY775178)、C株(GenBank登錄號為Z46258)、HCLV株(GenBank登錄號為AF531443)］相比存在多個氨基酸變異位點。傳統(tǒng)CSFV檢測技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，但近年來出現(xiàn)的許多基于傳統(tǒng)檢測技術(shù)創(chuàng)新而來的新型CSFV檢測技術(shù)，在靈敏度、操作方法、檢測成本等方面都有所優(yōu)化。筆者綜述了傳統(tǒng)CSFV檢測技術(shù)及新型CSFV檢測技術(shù)的研究進展，旨在為臨床CS-FV檢測提供方法參考。

ELISA是將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上進行免疫反應(yīng)的一種定性和定量方法，是臨床上最受歡迎的檢測CSFV方法之一。陳九等利用大腸桿菌表達CSFVE2蛋白主要抗原區(qū)，建立了CSFV間接ELISA抗體檢測方法，并對556份臨床疑似豬瘟樣品進行檢測，結(jié)果表明，與豬瘟阻斷ELISA試劑盒(美國IDEXX公司生產(chǎn))的陽性符合率為90.8%，陰性符合率為93.29%，總符合率為91.52%。侯玉珍等建立了針對CSFVE2重組蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測方法，結(jié)果表明，CSFVE2蛋白標(biāo)準品的稀釋濃度在2.43~77.65μg/mL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，且重復(fù)性試驗的變異系數(shù)小于15%，表明該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，為CSFVE2蛋白的定量檢測提供了良好的方法。吳許丹等建立了檢測CSFV EO抗體的ELISA方法，結(jié)果表明，該方法特異性、穩(wěn)定性和靈敏性均良好。ELISA具有靈敏度高、操作簡單快速、抗原不需要提前純化、重復(fù)性好等優(yōu)點，但存在成本較高、專一性較差、交叉反應(yīng)發(fā)生的概率高、操作過程被局限在實驗室而不能進行室外檢測等缺點，見表1。

1.2 聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)

PCR是臨床上最常用的CSFV檢測方法之一，具有快速、經(jīng)濟、特異性強等優(yōu)勢。目前，許多地區(qū)發(fā)生的豬瘟已不再由單一的CSFV感染所引起，而是由多種病毒混合感染所引起。史喜菊等建立了同時可檢測和鑒別CSFV、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)和豬水泡病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)的多重?zé)晒饽孓D(zhuǎn)錄PCR(revers transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法，結(jié)果表明：該方法最低檢測量可達到1~10拷貝/μL，特異性高達100%。楊峰等建立了檢測CSFV的實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)方法，結(jié)果表明該方法具有特異性強(只能檢測出CSFV)、靈敏度高(最低檢測量可達到24.47拷貝/μL)、重復(fù)性好等特點。PCR具有取樣少、靈敏度高、操作快速簡便等優(yōu)點，RT-qPCR可同時對病原體進行定量和定性檢測，由于采用封閉檢測模式，因此擴增產(chǎn)物污染的可能性比普通PCR要小得多；但PCR儀器設(shè)備昂貴，操作專業(yè)性強、過程復(fù)雜，且在基因擴增過程中容易出現(xiàn)錯配現(xiàn)象，使得檢測結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性。見表1。

2.1 免疫層析試紙條檢測技術(shù)

免疫層析試紙條檢測技術(shù)是基于免疫標(biāo)記技術(shù)和色譜層析技術(shù)發(fā)展起來的一種可用于檢測抗原、抗體或半抗原的檢測技術(shù)。萬穎等將膠體金顆粒標(biāo)記的CSFVE2蛋白及其單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrance,NC)上，分別作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，組裝成檢測CSFVE2蛋白抗體的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條可在5~10min之間完成檢測，且與其他病毒的陽性血清無交叉反應(yīng)，特異性強，靈敏度高。Li X．等基于CS-FVCnC2蛋白研制了一種用于快速檢測免疫豬瘟疫苗后的豬血清中CSFV抗體效價的免疫層析試紙條，即將葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal aureus protein A,SpA)和抗CnC2單克隆抗體(anti-CnC2 monoclonal antibodies,mAbs)吸附于NC上，分別作為檢測線和質(zhì)控線，該試紙條可在5min內(nèi)完成檢測，且不需要任何特殊設(shè)備；利用該試紙條對含有不同CSFV株血清樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)其敏感性為97.0%，特異性為100%，與CSFV AbELISA試劑盒(購自美國IDEXX公司)檢測結(jié)果一致，相關(guān)系數(shù)為0.935。Bai Y．等開發(fā)了一種基于CSFV重組E2蛋白的新型高敏免疫層析試紙條，用于CSFV抗體檢測，其靈敏度是CnC2試紙條的4倍。免疫層析試紙條操作快速簡單，成本低，無需專業(yè)的技術(shù)人員或昂貴的設(shè)備，是一種靈敏度和特異性均高的高通量檢測方法，但是其所用的病毒抗原是通過重新折疊的蛋白質(zhì)，沒有完全恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，含有半折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)，降低了檢測效率，見表1。

2.2 免疫色譜橫向流動檢測(immunochromatographic lateral flow assay,LFA)

R．Sambandam等開發(fā)了一種用于檢測CSFV的LFA方法，最低檢測限為36.8 TCID50/mL，該方法的靈敏度和特異性分別為80.36%和87.10%，用該方法檢測了72份臨床樣品，陽性和陰性檢出率分別為91.84%和87.10%。P．Sastre等為了能同時檢測和區(qū)分CSFV和ASFV抗體，基于CSFVE2蛋白和ASFV VP72蛋白開發(fā)了一種LFA方法，結(jié)果表明，該方法能夠檢測到ASFV或CSFV抗體，顯示出良好的靈敏度和特異性。CSFV-LFA是一種用于臨床的操作快速的診斷CSFV的方法，無需專業(yè)的技術(shù)人員或設(shè)備，生產(chǎn)成本相對較低，重復(fù)性好，但是判定結(jié)果依賴于肉眼觀察，靈敏度較低，見表1。

2.3 抗原捕獲酶免疫分析(antigen-capture enzymeimmuno assay,EIA)

A．Clavijo等開發(fā)了一種用于檢測CSFV抗原的EIA方法，該方法可直接從組織懸液中檢測到CSFV抗原，特異性為98.7%，敏感性為91.4%，且操作簡單，可在4h內(nèi)完成檢測，并可用于篩查疑似CS-FV感染的豬只組織樣本。EIA對樣本類型要求不高，特異性強，靈敏度高，該方法基于抗原和抗體反應(yīng)，受pH值、離子強度、有機溶劑、反應(yīng)溫度等的影響很大，見表1。

2.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassays,CLIA)

MaZ．等利用CSFV E2重組蛋白和過氧化酶結(jié)合MAb開發(fā)了一種競爭性化學(xué)發(fā)光免疫分析(competition-based chemiluminescence immunoassays,cCLIA)方法，用于快速、準確地檢測豬血清中CSFVE2抗體，結(jié)果表明，該方法的靈敏度和特異性均高于競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(competition-based enzyme-linked immunosorbent assay, cELISA)，且可以在20min內(nèi)完成檢測，而cELISA至少需要1h。cCLIA方法具有靈敏度高、信噪比高、耗時短等優(yōu)點，在CSFV的診斷中能夠大幅度的節(jié)省時間，具有很高的應(yīng)用價值，但成本較高，儀器故障率較高，發(fā)光過程短。見表1。

2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是多種核酸擴增技術(shù)中的一種，即通過對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計3對特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下作用30~60min內(nèi)完成擴增反應(yīng)。Chen L．等建立了一種簡單、快速的用于檢測CSFV的反轉(zhuǎn)錄循環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法，即通過利用一對外部引物、一對內(nèi)部引物和一對循環(huán)引物在恒溫條件下檢測CSFV，結(jié)果表明，該方法靈敏度高于RT-PCR。

ChenH.T.等評估了RT-LAMP方法對經(jīng)典CSFV感染的臨床樣品的檢測效果，結(jié)果表明：RT-LAMP可以在65℃的恒溫條件下1h內(nèi)完成檢測，同時對未接種豬瘟疫苗的豬的血液、扁桃體、鼻拭子等樣本進行RT-LAMP、RT-PCR和病毒分離，三種檢測技術(shù)的檢出率分別為89%、78%和71%，表明RT-LAMP方法較其他兩種方法敏感性高，但該方法一次只能檢測5份樣品，與RT-PCR方法相比檢測進度比較慢。RT-LAMP方法是一種快速、經(jīng)濟、高效的用于檢測CSFV工具，對經(jīng)典豬瘟的快速臨床前檢查和監(jiān)測具有潛在效用。見表1。

2.6 重組酶介導(dǎo)擴增(recombinase-aid amplification,RAA)

RAA是一種可以在恒溫下快速擴增核苷酸的方法，通常在1h內(nèi)完成檢測，由于整個反應(yīng)不需要高溫循環(huán)，因此適合在非實驗室場合且有大量需要檢測的臨床樣品情況下使用。已有研究結(jié)果表明，RAA可用于ASFV和PCV2的快速檢測。TuF.等開發(fā)了一種基于熒光探針的用于檢測CSFV的實時逆轉(zhuǎn)錄重組酶輔助擴增(real-time reverse transcription recombinase-aid amplification，rRT-RAA)檢測方法，靶向所有CSFV基因型中5′非翻譯區(qū)域(5′non-translated region,5′NTR)內(nèi)的高度保守位置，結(jié)果表明，該方法具有良好的重復(fù)性、特異性和靈敏性，并且可以肉眼在便攜式藍光成像儀下看到rRT-RAA擴增產(chǎn)物，是一種可以現(xiàn)場檢測CSFV的實用性較強的診斷工具。薛俊欣等建立了基于RAA-Cas13a的CSFV檢測方法，對不同濃度的陽性質(zhì)粒、陽性樣品和7種其他豬病病毒樣品進行RAA擴增，擴增產(chǎn)物中加入Cas13a酶切體系，然后收集熒光，結(jié)果表明，Cas13a酶切體系可以放大普通RAA檢測信號，從而提高RAA反應(yīng)的靈敏度，該方法特異性良好，檢測變異系數(shù)小于5%，可進行現(xiàn)場測試，具有推廣應(yīng)用的潛力，對重組酶的純度要求較高，任何雜質(zhì)都有可能影響反應(yīng)結(jié)果，同時還需要3種或4種酶參與擴增反應(yīng)，它們之間需要合理的比例，才能夠得到預(yù)期的擴增結(jié)果。見表1。

2.7 微滴式數(shù)字PCR(microdropled digital PCR，ddPCR)

ddPCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上對擴增前樣品進行稀釋處理，即將樣品分為若干微滴小份，每小份可能含有或不含有待檢核酸，經(jīng)擴增后，對每小份進行檢測，通過熒光信號結(jié)合泊松分布原理來判斷核酸的含量。近年來，ddPCR廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物檢測、腫瘤相關(guān)基因檢測中。高曉龍等建立了用于檢測CSFV的ddPCR方法，該方法最低檢測限為3.2拷貝/μL，靈敏度高，在讀取結(jié)果時僅判斷陽性或陰性，受擴增效率的影響較低，且不依賴Ct值或內(nèi)參基因即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目，適合于拷貝數(shù)變異研究、極低核酸分子含量樣品的檢測，但是該方法一次只能檢測一種樣品，使用范圍比較單一，且需要精密儀器，成本較高，不適合常規(guī)檢測。見表1。

2.8 其他新型檢測技術(shù)

C.Aira等開發(fā)了一種基于三重磁珠的檢測方法，即采用ASFV的VP72和VP30蛋白和CSFV的E2蛋白這些最具免疫原性的抗原來同時檢測兩種病毒抗體，其中對CSFV抗體的檢測靈敏度為95.7%，特異性為99.8%。這種多重檢測方法可以同時區(qū)分和檢測ASFV和CSFV抗體，降低成本的同時減少了工作量，為病毒檢測提供了有價值的工具，然而該技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用較少，且只有少數(shù)商用試劑盒可用。見表1。

Y.K.Kim等建立了用以快速區(qū)分3個基因型的CSFVDNA芯片檢測方法，即從臨床樣本中提取CSFVRNA進行反轉(zhuǎn)錄后擴增，將擴增產(chǎn)物與CSFVDNA芯片雜交，然后進行熒光掃描檢測CSFV。該方法可快速、準確地區(qū)分CSFV基因型，有助于CSFV根除策略的實施，但該方法還處于研發(fā)階段，且需要一系列價格昂貴的儀器，還沒有形成產(chǎn)品進行大量使用。見表1。

WuY.等開發(fā)了一種以豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、CSFV４種病毒蛋白為捕獲抗原的新型熒光蛋白質(zhì)芯片檢測方法，結(jié)果表明，陽性樣品的檢出率在95%以上且無交叉反應(yīng)。這種蛋白質(zhì)生物芯片方法具有操作快速、簡單、靈敏度高的優(yōu)點，但因為其制備成本很高，尚未廣泛用于動物疾病的檢測。見表1。

Guo X.等設(shè)計了檢測CSFV的磁彈性傳感器檢測系統(tǒng)，結(jié)果表明，該系統(tǒng)的靈敏度約為95Hz/(μg·mL)，檢測限為0.6μg/mL，雖然傳感器信號容易受到周圍介質(zhì)影響，但靈敏度和特異性都很好，且成本低，在未來CSFV檢測中有良好的應(yīng)用前景。見表1。Zhang Q.等首次提出了ViewRNA原位雜交(insituhybridization,ISH)方法，以揭示CSFVRNA在PK15細胞中的動態(tài)分布。ViewRNAISH的靈敏度比熒光抗體測試(fluorescent antibody test,FAT)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemical,IHC)方法高，且對CSFV有很強的特異性，與其他豬相關(guān)病毒沒有交叉反應(yīng)。ViewRNAISH能對病毒做定性、定量、定位分析，靈敏度高，特異性好，但因試劑價格昂貴而未上市。見表1?！　?/span> 

S.Klangprapan等設(shè)計了一種以分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP)為受體的石英晶體微量天平(quartz crystal microbalance,QCM)傳感器，用于檢測CSFV。MIP價格低廉，并產(chǎn)生與天然受體相當(dāng)?shù)母哂H和力和選擇性，因此該檢測傳感器可以在短時間內(nèi)檢測到CSFV，為CSFV的快速檢測開辟了一條新的道路，但尚未廣泛應(yīng)用。見表1。

NingP.等設(shè)計了一種檢測CSFV的金納米顆粒探針，原理是金納米顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)可以與CSFVRNA互補的DNA結(jié)合，進而產(chǎn)生熒光信號來證明病毒的存在。該方法檢測速度快、靈敏度高，而無需病毒核酸擴增，可應(yīng)用于動物疫病防控，但該探針的制作步驟復(fù)雜且有一定難度，不適用于CSFV的一般檢測。見表1。

豬瘟是一種具有高度傳染性的疾病，屬于一類動物疫病。近年來由于CSFV相關(guān)疫苗大量使用，使得大規(guī)模的豬瘟疫病爆發(fā)概率明顯降低，但是一旦出現(xiàn)強變異毒株，現(xiàn)有疫苗將不會發(fā)揮很好的作用，所以做好養(yǎng)豬場防疫凈化至關(guān)重要。目前傳統(tǒng)ELISA和PCR方法因具有良好的靈敏性和特異性、高效且檢測快速的優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用。近幾年新型檢測技術(shù)層出不窮，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點，如需進行現(xiàn)場檢測可采取RT-RAA或LFA；如果考慮檢測成本，可用免疫層析試紙條、LAMP或LFA進行檢測；如果一次需檢測大量樣品，則不能用LAMP和ddPCR進行檢測。因此在進行CSFV檢測時應(yīng)該結(jié)合自身設(shè)備條件及檢測的樣本量而選擇最適合的檢測方法。

參考文獻：略