科研動態(tài)

論文導(dǎo)讀

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、高度傳染性的動物疾病，主要影響偶蹄動物，對農(nóng)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。FMDV 屬于小核糖核酸病毒科的阿夫薩病毒屬，具有七個(gè)不同的血清型，且不同血清型之間沒有交叉保護(hù)，這給疫苗開發(fā)帶來了巨大挑戰(zhàn)。盡管已有研究探討了FMDV與宿主自噬作用的關(guān)系，但FMDV與非典型自噬之間的相互作用尚不明確。特別是，ATG16L1的WD40結(jié)構(gòu)域在非典型自噬過程中對LC3的招募至關(guān)重要，但其在FMDV復(fù)制中的作用尚未被充分研究。

2024年8月23日，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)＆蘭獸研在BMC Genomics在線發(fā)表了題為“Knockout of the WD40 domain of ATG16L1 enhances foot and mouth disease virus replication”的最新研究成果。該研究旨在通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除PK15細(xì)胞中的WD40結(jié)構(gòu)域，以探討非典型自噬對FMDV復(fù)制的影響，進(jìn)而為理解病毒-宿主相互作用提供新的視角，并為防治口蹄疫提供潛在的策略。

主要研究結(jié)果

本研究中，通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了WD40結(jié)構(gòu)域敲除的PK15細(xì)胞系（WD40-KO-PK15），并通過基因組測序和Western blotting驗(yàn)證了WD40基因的成功敲除。實(shí)驗(yàn)觀察顯示，WD40基因敲除并未影響細(xì)胞的正常生長，細(xì)胞的生長曲線與野生型PK15細(xì)胞（WT-PK15）相同。此外，通過光學(xué)顯微鏡觀察和核型分析，WD40-KO-PK15細(xì)胞在形態(tài)和染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)量上與WT-PK15細(xì)胞沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，WD40基因敲除的細(xì)胞系在形態(tài)和染色體水平上保持穩(wěn)定，為后續(xù)研究FMDV復(fù)制的影響提供了可靠的細(xì)胞模型。

圖1.PK 15細(xì)胞敲除WD40的鑒定

圖2.細(xì)胞形態(tài)分析

2.WD 40敲除增強(qiáng)FMD復(fù)制

在本研究中，通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）來評估WD40敲除對FMDV復(fù)制的影響。WD40-KO-PK15細(xì)胞與WT-PK15細(xì)胞相比，在感染FMDV后展現(xiàn)出更明顯的CPE，且WD40-KO-PK15細(xì)胞中FMDV陽性細(xì)胞的數(shù)量是WT-PK15細(xì)胞的2.5倍。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，WD40-KO-PK15細(xì)胞中FMDV的VP1蛋白和LC3 II的表達(dá)增加，病毒mRNA水平和病毒滴度也顯著高于WT-PK15細(xì)胞。此外，通過RNA干擾技術(shù)敲低WD40后，PK15細(xì)胞中FMDV的復(fù)制同樣增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，WD40的缺失或抑制顯著促進(jìn)了FMDV在PK15細(xì)胞中的復(fù)制，揭示了WD40在宿主抗病毒反應(yīng)中的潛在作用。

圖3.口蹄疫病毒的生長特征

圖4.WD 40敲除增強(qiáng)FMD復(fù)制

圖5.通過SiRNA敲除WD 40顯著增強(qiáng)了FMDV在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制

3.WT-PK 15和WD 40-KO-PK 15在FMTD感染下的基因表達(dá)差異

在本研究中，通過比較WT-PK15細(xì)胞和WD40-KO-PK15細(xì)胞在FMDV感染后的基因表達(dá)差異，共鑒定出3982個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）。其中，1809個(gè)基因在WD40-KO-PK15細(xì)胞中上調(diào)，而2173個(gè)基因下調(diào)。這些DEGs涉及23個(gè)生物學(xué)過程和50個(gè)信號通路。KEGG分析顯示，與自噬、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、mTOR信號通路、TNF信號通路、內(nèi)吞作用和溶酶體等相關(guān)的DEGs數(shù)量分別為51、24、21、19、18、17、14、10和4個(gè)。此外，還涉及了MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路和NF-κB信號通路等。通過qRT-PCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，隨機(jī)選擇的與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因在FMDV感染的WT-PK15和WD40-KO-PK15細(xì)胞中的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組分析一致。這些發(fā)現(xiàn)表明，WD40-KO-PK15細(xì)胞是研究FMDV感染和宿主抗病毒反應(yīng)的有效工具。

圖6.WT-PK 15和WD 40-KO-PK 15感染FMD后基因表達(dá)差異

圖7.RT-qPCR驗(yàn)證RN-seq數(shù)據(jù)

研究總結(jié)

本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了WD40結(jié)構(gòu)域敲除的PK15細(xì)胞系（WD40-KO-PK15），并證實(shí)了WD40基因的敲除對細(xì)胞的正常生長和染色體穩(wěn)定性沒有負(fù)面影響。通過對比WD40-KO-PK15細(xì)胞和野生型PK15細(xì)胞在FMDV感染后的表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)WD40基因的敲除顯著增強(qiáng)了FMDV的復(fù)制能力，這表明WD40在抑制FMDV復(fù)制中發(fā)揮著重要作用。

進(jìn)一步的基因表達(dá)分析揭示了在WD40-KO-PK15細(xì)胞中與自噬、免疫反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的多個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。這些差異表達(dá)基因的鑒定為理解非典型自噬在FMDV感染中的角色提供了新的分子證據(jù)，并可能揭示了宿主細(xì)胞內(nèi)抗病毒防御機(jī)制的新途徑。

綜上所述，WD40-KO-PK15細(xì)胞系的建立不僅為研究FMDV的復(fù)制機(jī)制提供了一個(gè)有價(jià)值的模型，而且為開發(fā)針對口蹄疫的新型預(yù)防和治療策略奠定了基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了非典型自噬在病毒感染中的重要性，并可能有助于設(shè)計(jì)針對FMDV及其他病毒性疾病的干預(yù)措施。

https://doi.org/10.1186/s12864-024-10703-6